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NAD-蘋果酸酶試劑盒說明書-相關技術文章

更新時間:2025-02-17      瀏覽次數:800


 

NAD-蘋果酸酶(Malic enzymeNAD-ME試劑盒說明書

微量法 100 /96 

正式測定前務必取 2-3 個預期差異較大的樣本做預測定測定意義:

ME 廣泛存在于微生物、培養(yǎng)細胞、動物和植物胞漿中,尤其在植物組織中活性較高。ME 催化蘋果酸氧化脫羧的可逆反應,產生丙酮酸和CO2,以及伴隨NAD(P)+的還原反應,是蘋果酸代謝的關鍵酶。 ME 活性與生物合成和抗氧化密切相關。近年來植物 ME 活性測定較多,已經成為抗氧化研究的熱點。根據輔酶專一性和對底物特異性的不同,可將ME 分為NAD-ME(EC1.1.1.38)NADP-ME(EC1.1.1.40)

測定原理:

NAD-ME 催化NAD+還原成NADH,在 340nm 下測定NADH 增加速率。

組成:

 

產品名稱

BF6008-100T/96S

Storage

提取液:

100ml

4℃

試劑一:液體

20ml

4℃

試劑二:液體

10ml

4℃

試劑三:粉劑

1

-20℃

說明書

一份

 

自備儀器和用品:

紫外分光光度計、水浴鍋、臺式離心機、可調式移液器、1 ml 石英比色皿和蒸餾水。

樣本的前理:

1、細菌、細胞或組織樣品的制備:

細菌或培養(yǎng)細胞:先收集細菌或細胞到離心管內,離心后棄上清;按照細菌或細胞數量(104 個):提取液體積(ml 500~10001 的比例(建議 500 萬細菌或細胞加入 1ml 提取液),超聲波破碎細菌或細胞(冰浴,功率 20%或 200W,超聲 3s,間隔 10s,重復 30 次);8000g 4℃離心 10min,取上清,置冰上待測。

組織:按照組織質量(g):提取液體積(ml) 15~10 的比例(建議稱取約 0.1g 組織,加入 1ml 提取液),進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min,取上清,置冰上待測。

2、血清(漿)樣品:直接檢測。

測定步驟:

1、分光光度計或酶標儀預熱 30min 以上,調節(jié)波長至 340nm,蒸餾水調零。

2、檢測工作液的配制:用時在試劑三中加入 15ml 試劑一和 1ml 蒸餾水,充分混勻待用;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復凍融。

3、測定前將檢測工作液在 37℃(哺乳動物) 25℃(其它物種)水浴 10min 以上。

4、在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 10μl 樣本、55μl 試劑二和 160μl 工作液,混勻后立即記錄 340nm

處初始吸光值A1 1min 后的吸光值A2,計算ΔA=A2-A1 注意:如果ΔA0.005,可將反應時間延長到 2 分鐘或 5 分鐘。 NAD-ME 活性計算:

a. 用微量石英比色皿測定的計算公式如下

(1) 按樣本蛋白濃度計算:

單位的定義:每mg 組織蛋白每分鐘生成 1 nmol NADH 定義為一個酶活力單位。

NAD-MEnmol/min/mg prot)=[ΔA×V 反總÷ε×d×109]÷(V ×Cpr) ÷T= 3617×ΔA÷Cpr

此法需要自行測定樣本蛋白質濃度。

(2) 按樣本鮮重計算:

單位的定義:每g 組織每分鐘生成 1 nmol NADH 定義為一個酶活力單位。

NAD-MEnmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V 反總÷ε×d×109]÷(W× V ÷V 樣總) ÷T = 3617×ΔA÷W

(3) 按細菌或細胞密度計算:

單位的定義:每 1 萬個細菌或細胞每分鐘生成 1 nmol NADH 定義為一個酶活力單位。

NAD-MEnmol/min/104 cell=[ΔA×V 反總÷ε×d×109]÷(500×V ÷V 樣總) ÷T =7.234×ΔA

V 反總:反應體系總體積,2.25×10-4 LεNADH 摩爾消光系數,6.22×103 L / mol /cmd:比色皿光徑, 1cmV 樣:加入樣本體積,0.01 mlV 樣總:加入提取液體積,1 mlT:反應時間,1 minCpr:樣本蛋白質濃度,mg/mlW:樣本質量,g500:細菌或細胞總數,500 萬。

b.  96 孔板測定的計算公式如下

(1) 按樣本蛋白濃度計算:

單位的定義:每mg 組織蛋白每分鐘生成 1 nmol NADH 定義為一個酶活力單位。

NAD-MEnmol/min/mg prot)=[ΔA×V 反總÷ε×d×109]÷(Cpr×V ) ÷T= 7234×ΔA÷Cpr

此法需要自行測定樣本蛋白質濃度。

(2) 按樣本鮮重計算:

單位的定義:每g 組織每分鐘生成 1 nmol NADH 定義為一個酶活力單位。

NAD-MEnmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V 反總÷ε×d×109]÷(V ÷V 樣總×W) ÷T = 7234×ΔA÷W

(3) 按細菌或細胞密度計算:

單位的定義:每 1 萬個細菌或細胞每分鐘生成 1 nmol NADH 定義為一個酶活力單位。

NAD-MEnmol/min/104 cell=[ΔA×V 反總÷ε×d×109]÷(V ÷V 樣總×500) ÷T =14.468×ΔA

V 反總:反應體系總體積,2.25×10-4 LεNADH 摩爾消光系數,6.22×103 L / mold96 孔板光徑,0.5cm V 樣:加入樣本體積,0.01 mlV 樣總:加入提取液體積,1 mlT:反應時間,1 minCpr:樣本蛋白質濃度,mg/mlW:樣本質量;500:細菌或細胞總數,500 萬。


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