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輔酶ⅡNADP(H)含量試劑盒說明書-相關技術文章

更新時間:2025-02-17      瀏覽次數:875


輔酶ⅡNADP(H)含量試劑盒說明書

 

微量法 100 /48 

 

正式測定前務必取 2-3 個預期差異較大的樣本做預測

測定意義:

輔酶ⅡNADP(H)廣泛存在于動物、植物、微生物和培養細胞中,NADP+NADPH 含量測定可以計算 NADPNADPH + NADP+ )含量和 NADPH/NADP+比值,其變化與磷酸戊糖途徑和生物合成以及抗氧化反應密切相關。NADPH/NADP+比值不僅是細胞氧化還原態的主要標志之一,而且在 PPP 途徑、生物合成和抗氧化代謝中具有重要調控作用。

測定原理:

分別用酸性和堿性提取液提取樣品中 NADP+NADPH。NADPH 通過PMS 的遞氫作用,使氧化型噻唑藍(MTT)還原為甲瓚,570nm 下檢測吸光值,從而測定NADPH 含量。利用 6-磷酸葡萄糖脫氫酶還NADP+NADPH,從而檢測NADP+含量。

組成:

 

產品名稱

BF6002-100T/48S

Storage

提取液:酸性提取液

50ml

4℃

提取液:堿性提取液

50ml

4℃

試劑一:液體

10ml

4℃

試劑二:粉劑

1

-20℃

試劑三:粉劑

1

-20℃

試劑四:粉劑

1

4℃

試劑五:液體

3.6ml

4℃

試劑六:液體

30ml

4℃

試劑七:液體

50ml

4℃

說明書

一份

 

試劑二:粉劑×1 支,-20 保存,用時加入 3ml 蒸餾水,混勻;溶解后 4 保存一周;試劑三:粉劑×1 支,-20℃保存,用時加入 3ml 蒸餾水,混勻;溶解后 4℃保存一周;試劑四:粉劑×1 支,4 ℃保存,用時加入 3ml 蒸餾水,混勻;溶解后 4℃保存一周;

自備儀器和用品:

酶標儀、臺式離心機、可調式移液器、96 孔板、研缽、冰和蒸餾水。

NADP+ NADPH 的提?。?/span>

1、 血清(漿) NADP+NADPH 的提取

NADP+的提取:按照血清(漿)體積(ml):酸性提取液體積(ml 15~10 的比例(建議取約 0.1ml

血清(漿),加入 1ml 酸性提取液),95℃水浴 5min(蓋緊,以防止水分散失);冰浴中冷卻后,10000g 4 離心 10min;取 500μl 上清液,加入 500μl 堿性提取液使之中和,混勻,10000g 4 離心 10min,取上清,置冰上待測。

NADPH 的提取:按照血清(漿)體積(ml):堿性提取液體積(ml 15~10 的比例(建議取約 0.1ml

血清(漿),加入 1ml 堿性提取液),95℃水浴 5min(蓋緊,以防止水分散失);冰浴中冷卻后,10000g 4 離心 10min;取 500μl 上清液,加入 500μl 酸性提取液使之中和,混勻,10000g 4 離心 10min,取上清,置冰上待測。

2、組織中NADP+NADPH 的提取

NADP+的提取:按照組織質量(g):酸性提取液體積(ml 15~10 的比例(建議取約 0.1g 組織,加

1ml 酸性提取液),冰浴研磨,95℃水浴 5min(蓋緊,以防止水分散失);冰浴中冷卻后,10000g 4 離心 10min;取 500μl 上清液,加入 500μl 堿性提取液使之中和,混勻,10000g 4 離心 10min,取上清,置冰上待測。

NADPH 的提取:按照組織質量(g):堿性提取液體積(ml 15~10 的比例(建議取約 0.1g 組織,

加入 1ml 堿性提取液),冰浴研磨,95℃水浴 5min(蓋緊,以防止水分散失);冰浴中冷卻后,10000g 4 離心 10min;取 500μl 上清液,加入 500μl 酸性提取液使之中和,混勻,10000g 4 離心 10min,取上清,置冰上待測。

3 細胞或細菌中 NADP+NADPH 的提取

NADP+的提取:先收集細胞或細菌到離心管內,棄上清,按照細菌或細胞數量(104 個):酸性提取液體

積(ml 500~10001 的比例(建議 500 萬細菌或細胞加入 1ml 酸性提取液),超聲波破碎(冰浴,功 20%或 200W,超聲 3s,間隔 10s,重復 30 次),95℃水浴 5min(蓋緊,以防止水分散失);冰浴中冷卻后,10000g 4 ℃離心 10min;取 500μl 上清液,加入 500μl 堿性提取液使之中和,混勻,10000g 4 ℃離心 10min,取上清,置冰上待測。

NADPH 的提取:先收集細胞或細菌到離心管內,棄上清,按照細菌或細胞數量(104 個):堿性提取液體

積(ml 500~10001 的比例(建議 500 萬細菌或細胞加入 1ml 堿性提取液),超聲波破碎(冰浴,功 20%或 200W,超聲 3s,間隔 10s,重復 30 次),95℃水浴 5min(蓋緊,以防止水分散失);冰浴中冷卻后,10000g 4 ℃離心 10min;取 500μl 上清液,加入 500μl 酸性提取液使之中和,混勻,10000g 4 ℃離心 10min,取上清,置冰上待測。

測定步驟:

1、分光光度計或酶標儀預熱 30min 以上,調節波長至 570nm,蒸餾水調零。

2、加樣表( 1.5ml 棕色EP 管中按下表依次加樣):

試劑名稱(μl)

對照管

測定管

樣本

20

20

試劑一

80

80

試劑二

30

30

試劑三

30

30

 


試劑四

30

30


試劑五

30

30

試劑六

200

混勻,室溫避光靜置 20min

試劑六


200

充分混勻,靜置 5min 后,20000g,25℃離心 5min,棄上清,沉淀中加入:

試劑七

400

400

混勻,取 200μl 轉移至微量石英比色皿或 96 孔板中,570nm 下讀取對照吸光值 A1 和測定管吸光值

A2,計算A=A2-A1。

 

注意事項

1、如果一次性測定樣本數較多,可將試劑一、二、三和四按比例配成混合液。

2、對照管和測定管的測定步驟的區別:對照管加完試劑一、二、三、四和五后必須馬上加試劑六;測定管加完試劑一、二、三、四和五后必須反應 20min 后再加試劑六。

3、反應過程中注意避光。

4、若NADP+測定中AA2-A1≤0.0144NADPH 測定中AA2-A1≤0.0259,說明樣本中輔酶含量較低,已低于檢測限,可做如下調整:(1將測定管避光靜置時間 20min 延長到 60min;(2)在提取階段增加取樣量,即取 0.2g 樣本或 0.2ml 樣本加入 1ml 提取液。

5、由于每一個測定管需要設一個對照管,本試劑盒 100 管保證測 48 NADP+NADPH.

 

NADP+ NADPH 含量的計算:

(一)NADP+含量的計算

標準條件下的回歸曲線為y = 0.0985x + 0.0144R2 = 0.9998;其中y A,x NADP+濃度nmol/ml 1、血清(漿) NADP+含量計算

NADP+含量(nmol/ml=[ (A -0.0144÷0.0985×V1) ]÷(V3×V1÷V2)= 203×(A -0.0144

2、組織、細菌或細胞中NADP+含量計算 (1)按樣本蛋白濃度計算

NADP+ (nmol/mg prot=[(A -0.0144÷0.0985×V1) ]÷(V1×Cpr)= 10.2×(A -0.0144÷Cpr

(2) 按樣本鮮重計算

NADP+ (nmol/g 鮮重)= [(A -0.0144÷0.0985×V1)] ÷(W×V1÷V2)=20.3×(A -0.0144÷W

(3) 按細菌或細胞密度計算

NADP+ (nmol/104 cell=[(A -0.0144÷0.0985×V1)] ÷(500×V1÷V2)=0.04×(A -0.0144

 

(二)NADPH 含量的計算

標準條件下的回歸曲線為y = 0.6198x + 0.0259,R2 = 0.9977;其中y A,x NADPH 濃度nmol/ml 1、血清(漿) NADPH 含量計算

NADPH 含量(nmol/ml= [(A -0.0259÷0.6198×V1)] ÷(V3×V1÷V2)= 32.3× (A -0.0259

2、組織、細菌或細胞中NADPH 含量計算

(1) 按樣本蛋白濃度計算

NADPH (nmol/mg prot=[ (A -0.0259÷0.6198×V1)] ÷(V1×Cpr)= 1.6× (A -0.0259÷Cpr


 

(2) 按樣本鮮重計算

NADPH (nmol/g 鮮重)=[(A -0.0259÷0.6198×V1) ]÷(W×V1÷V2)=3.2× (A -0.0259÷W

(3) 按細菌或細胞密度計算

NADPH (nmol/104 cell=[(A -0.0259÷0.6198×V1) ]÷(500×V1÷V2)=0.006× (A -0.0259

 

V1:加入反應體系中樣本體積,0.02ml;V2:加入提取液體積,2ml;V3:加入血清(漿)體積:0.1ml Cpr:樣本蛋白質濃度,mg/ml; W:樣本質量,g;500:細胞或細菌總數,500 萬。

注意:*低檢測限為 0.01nmol/ml  0.01nmol/g 鮮重 0.001nmol/mg prot


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