陶術(shù)  C0104B  Protein A/G Immunomagnetic Beads

陶術(shù) Protein A/G Immunomagnetic Beads

產(chǎn)品貨號(hào)：C0104B

產(chǎn)品名稱：Protein A/G Immunomagnetic Beads

產(chǎn)品規(guī)格：1ml/5ml

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

具體產(chǎn)品的參數(shù)以收到產(chǎn)品說(shuō)明書的參數(shù)為準(zhǔn)

粒徑：2 μm

Human IgG 能力（Antibody Capacity）：0.5~0.6 mg/mL

磁珠濃度：10 mg/mL

保存溶劑：1×PBS，含 0.1%（w/v）BSA，0.1%（V/V）proclin-300

適用抗體種屬：廣譜抗體種屬

應(yīng)用推薦：IP, Co-IP, ChIP

特點(diǎn)

非特異性吸附低：相較于當(dāng)前國(guó)際免疫磁珠市場(chǎng)上同類產(chǎn)品，本品具有更多的抗體結(jié)合位點(diǎn)，使用量更少，并且非特異性結(jié)合率低，能夠快速高效地進(jìn)行免疫沉淀實(shí)驗(yàn)。

高效率、高產(chǎn)量、低消耗：每毫升免疫沉淀磁珠結(jié)合 Human IgG 的能力可達(dá)到500 μg 以上，單個(gè)沉淀反應(yīng)僅需25 μL 磁珠即可完成檢測(cè)。

操作靈活、簡(jiǎn)便：微米級(jí)磁珠提供了超大比表面積，顯著縮短了抗體與抗原吸附所需的平衡時(shí)間，使抗體吸附過(guò)程在15 min內(nèi)完成，抗原沉淀操作在30 min內(nèi)完成。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠、重復(fù)性高：簡(jiǎn)短的操作時(shí)間避免了長(zhǎng)時(shí)間操作造成目標(biāo)蛋白水解的風(fēng)險(xiǎn)，保證了目標(biāo)蛋白的活性及蛋白復(fù)合物的完整性。

自備試劑

結(jié)合緩沖液 Binding Buffer：1×PBS, 1%（v/v）TritonX-100, 0.01%(v/v) NP-40, 5%(v/v) Glycerol

洗滌緩沖液 Washing Buffer：50 mM Tris-HCl，0.1%(v/v) Tween-20，pH7.5

洗脫緩沖液 Elution Buffer：0.1M Glycine，0.1% (v/v) Tween-20，pH2.5

中和緩沖液 Neutralization Buffer：1M Tris-HCl, pH 9.0

操作說(shuō)明

1. 抗原樣品制備

建議根據(jù)抗原樣品的不同來(lái)源選擇適當(dāng)?shù)念A(yù)處理方式，以便將待檢測(cè)抗原釋放到樣品溶液中。

1)血清樣品：如果目標(biāo)蛋白豐度較高，建議用Binding Buffer將血清樣品稀釋至目標(biāo)蛋白終濃度為10~100 µg/mL，置于冰上備用，或于-20℃長(zhǎng)期保存。

2)懸浮細(xì)胞樣品：離心收集細(xì)胞（4℃, 500 g, 10 min），棄上清后稱重，按每毫克細(xì)胞50 µL的比例用1× PBS洗滌兩次。然后按每毫克細(xì)胞5~10 µL的比例加入Binding Buffer，同時(shí)加入蛋白酶抑制劑（1 mM PMSF 或蛋白酶抑制劑Cocktail C0001），混勻后置于冰上孵育10 min。離心收集上清液（4℃, 14000 g, 10 min），置于冰上備用，或于-20℃長(zhǎng)期保存。

3)貼壁細(xì)胞樣品：吸去培養(yǎng)基，按每1.0×10^5個(gè)細(xì)胞150 µL的比例用1×PBS洗滌兩次。用細(xì)胞刮刀收集細(xì)胞，置于1.5 mL EP管，按每1.0×10^5個(gè)細(xì)胞20~30 µL的比例加入Binding Buffer，同時(shí)加入蛋白酶抑制劑，混勻后置于冰上孵育10 min。離心收集上清液（4℃, 14000 g, 10 min），置于冰上備用，或于-20℃長(zhǎng)期保存。

4)大腸桿菌樣品：離心收集大腸桿菌（4℃, 12000 g, 2 min），棄上清后稱重，按每克（濕重）菌體10 mL的比例用1×PBS洗滌兩次。然后按每克（濕重）菌體5~10 mL的比例加入Binding Buffer，同時(shí)加入蛋白酶抑制劑，重懸菌體，超聲裂解細(xì)胞，離心收集上清（4℃, 17000 g, 10 min），置于冰上備用，或于-20℃長(zhǎng)期保存。

注：以上方法制備的抗原樣品適用于進(jìn)行IP和Co-IP實(shí)驗(yàn)，如需進(jìn)行ChIP實(shí)驗(yàn)，請(qǐng)另參照相關(guān)實(shí)驗(yàn)說(shuō)明（如CST #9003）。

2. 磁珠預(yù)處理

1)將免疫沉淀磁珠用漩渦振蕩器振蕩1 min，使磁珠重新懸浮，取25~50 µL磁珠懸液放入1.5 mL EP管中。

2)加入200 µL Binding Buffer進(jìn)行洗滌，將EP管放入磁性分離器，靜置1 min，進(jìn)行磁性分離，吸去上清液，取下EP管。重復(fù)上述洗滌步驟一次。

3)加入200 µL Binding Buffer重懸磁珠備用。

3. 抗體結(jié)合反應(yīng)

1)抗體工作液的制備：將抗體樣品用Binding Buffer稀釋至終濃度為5~50 µg/mL，制備成抗體工作液，置于冰上備用。

2)抗體吸附：將步驟2中預(yù)處理的磁珠懸液進(jìn)行磁性分離，吸去上清液。加入200 µL抗體工作液，迅速重懸磁珠，在室溫下使用翻轉(zhuǎn)混合儀或手工輕輕翻轉(zhuǎn)EP管混合15 min，然后進(jìn)行磁性分離，收集上清液，置于冰上備用以供后續(xù)檢測(cè)。

3)洗滌：向EP管中加入200 µL Binding Buffer進(jìn)行洗滌，輕輕用移液器吹打使磁珠-抗體復(fù)合物均勻分散，然后進(jìn)行磁性分離，吸去上清液，取下EP管。重復(fù)上述洗滌步驟一次。

4. 抗體交聯(lián)反應(yīng)（可選操作）

如需同時(shí)洗脫抗體和目標(biāo)抗原復(fù)合物，請(qǐng)?zhí)^(guò)本步驟，直接進(jìn)行步驟5。本步驟適用于需要單獨(dú)洗脫目標(biāo)抗原的實(shí)驗(yàn)，推薦使用BS3作為交聯(lián)劑。具體實(shí)驗(yàn)操作請(qǐng)參照該試劑的說(shuō)明書。

5. 抗原沉淀反應(yīng)

1)抗原吸附：加入200 µL步驟1中制備的抗原樣品，用移液器輕輕吹打，使抗原與磁珠-抗體復(fù)合物均勻分散。在室溫下使用翻轉(zhuǎn)混合儀或手工輕輕翻轉(zhuǎn)EP管混合10 min，以確保抗原與抗體充分結(jié)合。如結(jié)合力較弱，可在室溫下孵育1 h，或在4℃下孵育過(guò)夜。

2)洗滌與轉(zhuǎn)移：將上述完成抗原吸附的磁珠-抗體-抗原復(fù)合物進(jìn)行磁性分離，收集上清液，置于冰上以備后續(xù)檢測(cè)。向EP管中加入200 µL Washing Buffer進(jìn)行洗滌，用移液器輕輕吹打，使磁珠-抗體-抗原復(fù)合物均勻分散，然后進(jìn)行磁性分離，吸去上清液，取下EP管。重復(fù)洗滌兩次。最后，加入200 µL Washing Buffer，將磁珠-抗體-抗原復(fù)合物懸液轉(zhuǎn)移至新的1.5 mL EP管中，并進(jìn)行磁性分離，吸去上清液，取下EP管。

注：抗原洗脫前，需將磁珠轉(zhuǎn)移到新的EP管，以避免將管壁上非特異性吸附的蛋白一同洗脫。

6. 抗原洗脫

提供以下兩種抗原洗脫方案，用戶可根據(jù)后續(xù)檢測(cè)的需要選擇不同的洗脫方法。

1)變性洗脫法：此方法洗脫的樣品適用于SDS-PAGE檢測(cè)。向EP管中加入25 µL 1× SDS-PAGE Loading Buffer（自備），混合均勻，95℃加熱5 min。然后進(jìn)行磁性分離或者離心（室溫，13000 g, 10 min），收集上清液，進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)。

2)非變性洗脫法：此方法洗脫的樣品保持原有的生物活性，可用于后續(xù)功能分析。向EP管中加入20 µL Elution Buffer，混合均勻，室溫孵育10 min。然后進(jìn)行磁性分離或者離心（室溫，13000 g, 10 min），收集上清液至新的EP管，并立即加入1.0 µL Neutralization Buffer，將洗脫產(chǎn)物pH調(diào)節(jié)至中性，用于后續(xù)功能分析。

保存條件：4℃，2年。

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